實時熒光定量PCR，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。常見的熒光定量PCR檢測方法有SYBR Green I熒光嵌合法和熒光探針法。
SYBR Green I熒光嵌合法：
SYBR Green I 是一種能與雙鏈 DNA 結(jié)合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈 DNA 結(jié)合后， 熒光大大增強。因此， SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm，發(fā)射波長最大約為 520nm。PCR 擴增程序一般為 94℃～55℃～72℃三步法，40 個循環(huán)。SYBR Green I 的缺點：由于 SYBR Green I 沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會結(jié)合發(fā)光，對 PCR 反應(yīng)中的非特異性擴增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。
SYBR Green I 的優(yōu)點：SYBR Green I 的優(yōu)點是因為其缺點產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價格相對較低。這對科研是很有利的，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。
熒光探針法：
探針法通常是使用5’端帶有熒光物質(zhì)（如：FAM等），3’端帶有淬滅物質(zhì)（如：TAMRA、Eclipse、BHQ等）的探針進行熒光檢測的方法。當(dāng)探針完整時，5’端的熒光物質(zhì)受到3’端的淬滅物質(zhì)的制約，不能檢出熒光。探針的報告基團的發(fā)射波長要在淬滅基團的吸收波長范圍內(nèi)。
能用于實時熒光 PCR 定量的方法很多，各有優(yōu)缺點，必須根據(jù)具體的實驗用途進行選擇。如果用于區(qū)別同源性高的序列以及進行SNP分型解析等多重PCR檢測，推薦用熒光探針法，而進行除此之外的Real Time PCR實驗，我們推薦使用簡單易行、成本低的SYBR Green I熒光嵌合法。
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